الكشف عن نواتج تفاعلية جديدة في الأوتوكلاف المتشابك BDDE

الجافا سكريبت غير مفعل حاليا في متصفحك.عند تعطيل جافا سكريبت ، لن تعمل بعض وظائف هذا الموقع.
خافيير فيدالغو ، * بيير أنطوان ديجليسن ، * رودريجو أرويو ، * ليليان سيبولفيدا ، * إيفجينيا رانيفا ، قسم فيليب ديبريز للعلوم ، مجموعة سكين تك فارما ، كاستيلو دي إمبوريس ، كاتالونيا ، إسبانيا * هؤلاء المؤلفون لديهم بعض الأفكار حول هذا العمل متساوٍ خلفية المساهمة: حمض الهيالورونيك (HA) هو عديد السكاريد الطبيعي المستخدم في إنتاج الحشوات الجلدية لأغراض جمالية.نظرًا لأن عمر النصف له عدة أيام في الأنسجة البشرية ، يتم تعديل حشوات الجلد القائمة على HA كيميائيًا لإطالة عمرها في الجسم.التعديل الأكثر شيوعًا في الحشوات التجارية القائمة على HA هو استخدام 1،4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) كعامل تشابك لربط سلاسل HA.يعتبر BDDE المتبقي أو غير المتفاعل غير سام عند أقل من 2 جزء في المليون (جزء في المليون) ؛لذلك ، يجب تحديد كمية BDDE المتبقية في حشو الجلد النهائي لضمان سلامة المريض.المواد والطرق: تصف هذه الدراسة اكتشاف وتوصيف منتج ثانوي لتفاعل الارتباط المتبادل بين BDDE و HA في ظل الظروف القلوية من خلال الجمع بين كروماتوجرافيا السائل وقياس الطيف الكتلي (LC-MS).النتائج: بعد تحليلات مختلفة ، وجد أن الظروف القلوية ودرجة الحرارة المرتفعة المستخدمة لتطهير هيدروجيل HA-BDDE عززت تكوين هذا المنتج الثانوي الجديد ، وهو مركب "يشبه البروبيلين غليكول".أكد تحليل LC-MS أن المنتج الثانوي له نفس الكتلة أحادية النظير مثل BDDE ، ووقت استبقاء مختلف (tR) ، ووضع امتصاص للأشعة فوق البنفسجية مختلف (λ = 200 نانومتر).على عكس BDDE ، لوحظ في تحليل LC-MS أنه في ظل نفس ظروف القياس ، يكون لهذا المنتج الثانوي معدل اكتشاف أعلى عند 200 نانومتر.الخلاصة: تشير هذه النتائج إلى عدم وجود إيبوكسيد في بنية هذا المركب الجديد.المناقشة مفتوحة لتقييم مخاطر هذا المنتج الثانوي الجديد الموجود في إنتاج HA-BDDE hydrogel (HA dermal filler) للأغراض التجارية.الكلمات المفتاحية: حمض الهيالورونيك ، حشو جلدي HA ، حمض الهيالورونيك المتصالب ، BDDE ، تحليل LC-MS ، منتج ثانوي BDDE.
الحشوات التي تعتمد على حمض الهيالورونيك (HA) هي الحشوات الجلدية الأكثر شيوعًا والمستخدمة لأغراض التجميل.1 هذا الفيلر الجلدي عبارة عن هيدروجيل ، يتكون عادة من> 95٪ ماء و 0.5-3٪ HA ، مما يمنحهم بنية تشبه الهلام.2 HA هو عديد السكاريد والمكون الرئيسي للمصفوفة خارج الخلية للفقاريات.أحد المكونات.ويتكون من (1،4) -حامض الجلوكورونيك- β (1،3) -N-acetylglucosamine (GlcNAc) وحدات ديساكهاريد متكررة متصلة بواسطة روابط جليكوسيدية.نمط السكاريد هذا هو نفسه في جميع الكائنات الحية.بالمقارنة مع بعض الحشوات القائمة على البروتين (مثل الكولاجين) ، تجعل هذه الخاصية جزيء HA متوافقًا حيوياً للغاية.يمكن أن تظهر هذه الحشوات خصوصية تسلسل الأحماض الأمينية التي يمكن أن يتعرف عليها الجهاز المناعي للمريض.
عند استخدامه كحشو جلدي ، فإن القيد الرئيسي لـ HA هو دورانه السريع داخل الأنسجة بسبب وجود عائلة محددة من الإنزيمات تسمى الهيالورونيداز.حتى الآن ، تم وصف العديد من التعديلات الكيميائية في بنية HA لزيادة نصف عمر HA في الأنسجة.3 تحاول معظم هذه التعديلات تقليل وصول الهيالورونيداز إلى بوليمرات عديد السكاريد عن طريق ربط سلاسل HA.لذلك ، نظرًا لتشكيل الجسور والروابط التساهمية بين الجزيئات بين بنية HA وعامل الربط المتقاطع ، ينتج هيدروجيل HA المترابط منتجات تحلل إنزيم أكثر من HA الطبيعي.4-6
حتى الآن ، تشتمل عوامل التشابك الكيميائية المستخدمة لإنتاج حمض الهيدروكلوريك المتشابك على ميثاكريلاميد ، 7 هيدرازيد ، 8 كربوديميد ، 9 ديفينيل سلفون ، 1،4-بيوتانيديول ديجليسيديل إيثر (BDDE) وبولي (إيثيلين جلايكول) ديجليسيديل إيثر.10 ، 11 يعتبر BDDE حاليًا أكثر عوامل التشابك استخدامًا.على الرغم من أن هذه الأنواع من الهلاميات المائية قد ثبت أنها آمنة لعقود من الزمن ، فإن عوامل الربط المتشابك المستخدمة هي كواشف تفاعلية قد تكون سامة للخلايا وفي بعض الحالات مطفرة.12 لذلك ، يجب أن يكون محتواها المتبقي في هيدروجيل النهائي مرتفعًا.يعتبر BDDE آمنًا عندما يكون التركيز المتبقي أقل من 2 جزء في المليون (جزء في المليون).4
هناك عدة طرق لاكتشاف تركيز BDDE منخفض البقايا ودرجة الارتباط المتبادل وموضع الاستبدال في الهلاميات المائية HA ، مثل كروماتوغرافيا الغاز وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم المقترن بمقياس الطيف الكتلي (MS) وطرق قياس التألق بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، و صفيف الصمام الثنائي المقترن بالكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC).13-17 تصف هذه الدراسة اكتشاف وتوصيف منتج ثانوي في هيدروجيل HA النهائي المتشابك الناتج عن تفاعل BDDE و HA تحت الظروف القلوية.HPLC ومقياس الطيف الكتلي السائل (تحليل LC-MS).نظرًا لأن سمية هذا المنتج الثانوي للإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم غير معروفة ، فإننا نوصي بأن يتم تحديد كمية مخلفاته بطريقة مماثلة للطريقة التي يتم إجراؤها عادةً على BDDE في المنتج النهائي.
يبلغ وزن ملح الصوديوم الذي تم الحصول عليه من HA (Shiseido Co.، Ltd. ، طوكيو ، اليابان) حوالي 1،368،000 دا (طريقة لورنت) 18 ولزوجة داخلية تبلغ 2.20 م 3 / كجم.بالنسبة لتفاعل التشابك ، تم شراء BDDE (95٪) من شركة Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية).تم شراء محلول ملحي بالفوسفات مع pH 7.4 من شركة Sigma-Aldrich.تم شراء جميع المذيبات والأسيتونيتريل والمياه المستخدمة في تحليل LC-MS من جودة درجة HPLC.يتم شراء حمض الفورميك (98٪) كدرجة كاشف.
تم إجراء جميع التجارب على نظام اكتساب UPLC (ووترز ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم توصيله بمطياف كتلة ثلاثي رباعي الأقطاب API 3000 مجهز بمصدر تأين بالرش الكهربائي (AB SCIEX ، Framingham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).
بدأ تركيب هيدروجيل HA المتشابك بإضافة 198 مجم من BDDE إلى محلول 10٪ (وزن / وزن) هيالورونات الصوديوم (NaHA) في وجود 1٪ قلوي (هيدروكسيد الصوديوم ، NaOH).كان تركيز BDDE النهائي في خليط التفاعل 9.9 مجم / مل (0.049 ملي مولار).بعد ذلك ، يخلط خليط التفاعل جيدًا ويتجانس ويترك ليواصل عند 45 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.19 يتم الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للتفاعل عند ~ 12.
بعد ذلك ، تم غسل خليط التفاعل بالماء ، وتم ترشيح هيدروجيل HA-BDDE النهائي وتم تخفيفه باستخدام محلول PBS المؤقت لتحقيق تركيز HA من 10 إلى 25 مجم / مل ، ودرجة حموضة نهائية قدرها 7.4.من أجل تعقيم الهلاميات المائية HA المتصالبة المنتجة ، يتم تعقيم كل هذه الهلاميات المائية (120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).يتم تخزين هيدروجيل BDDE-HA المنقى عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
لتحليل BDDE الموجود في منتج HA المتشابك ، تم وزن عينة 240 مجم وإدخالها في الفتحة المركزية (Microcon® ؛ Merck Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ الحجم 0.5 مل) والطرد المركزي عند 10000 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة الغرفة 10 دقائق.تم جمع وتحليل ما مجموعه 20 ميكرولتر من السائل المنسد.
من أجل تحليل معيار BDDE (Sigma-Aldrich Co) تحت ظروف قلوية (1٪ ، 0.1٪ و 0.01٪ هيدروكسيد الصوديوم) ، إذا تم استيفاء الشروط التالية ، تكون العينة السائلة 1:10 ، 1: 100 ، أو حتى 1: 1،000،000 إذا لزم الأمر ، استخدم مياه MilliQ منزوعة الأيونات للتحليل.
بالنسبة لمواد البدء المستخدمة في تفاعل الارتباط المتبادل (HA 2٪ ، H2O ، 1٪ NaOH ، و 0.049 ملي مولار BDDE) ، تم تحليل 1 مل من كل عينة تم تحضيرها من هذه المواد باستخدام نفس ظروف التحليل.
لتحديد خصوصية القمم التي تظهر في خريطة الأيونات ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من 100 جزء في البليون من محلول BDDE القياسي (Sigma-Aldrich Co) إلى عينة 20 ميكرولتر.في هذه الحالة ، يكون التركيز النهائي للمعيار في كل عينة هو 37 جزء في البليون.
أولاً ، قم بإعداد محلول مخزون BDDE بتركيز 11000 مجم / لتر (11000 جزء في المليون) عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من BDDE القياسي (Sigma-Aldrich Co) مع 990 ميكرولتر من الماء (كثافة 1.1 جم / مل).استخدم هذا المحلول لتحضير محلول BDDE 110 ميكروجرام / لتر (110 جزء في البليون) كتخفيف معياري وسيط.بعد ذلك ، استخدم المخفف القياسي BDDE (110 جزء في البليون) لتحضير المنحنى القياسي عن طريق تخفيف المادة المخففة الوسيطة عدة مرات لتحقيق التركيز المطلوب وهو 75 ، و 50 ، و 25 ، و 10 ، و 1 جزء في البليون.كما هو مبين في الشكل 1 ، وجد أن منحنى BDDE القياسي من 1.1 إلى 110 جزء في البليون له خطية جيدة (R2> 0.99).تم تكرار المنحنى القياسي في أربع تجارب مستقلة.
الشكل 1 منحنى المعايرة القياسي BDDE الذي تم الحصول عليه عن طريق تحليل LC-MS ، حيث لوحظ وجود ارتباط جيد (R2> 0.99).
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي.
من أجل تحديد وقياس معايير BDDE الموجودة في معايير HA المتشابكة ومعايير BDDE في الحل الأساسي ، تم استخدام تحليل LC-MS.
تم تحقيق الفصل الكروماتوجرافي على عمود LUNA 2.5 ميكرومتر C18 (2) -HST (50 × 2.0 مم 2 ؛ Phenomenex ، Torrance ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) أثناء التحليل.يتكون الطور المتحرك من أسيتونيتريل (مذيب أ) وماء (مذيب ب) يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك.يتم التخلص من المرحلة المتنقلة عن طريق شطف التدرج.يكون التدرج كما يلي: 0 دقيقة ، 2٪ أ ؛دقيقة واحدة ، 2٪ أ ؛6 دقائق ، 98٪ أ ؛7 دقائق ، 98٪ أ ؛7.1 دقيقة ، 2٪ أ ؛10 دقائق ، 2٪ أ. وقت التشغيل 10 دقائق وحجم الحقن 20 ميكرولتر.تبلغ مدة استبقاء BDDE حوالي 3.48 دقيقة (تتراوح من 3.43 إلى 4.14 دقيقة بناءً على التجارب).تم ضخ الطور المتحرك بمعدل تدفق قدره 0.25 مل / دقيقة لتحليل LC-MS.
لتحليل BDDE والقياس الكمي بواسطة MS ، يتم دمج نظام UPLC (Waters) مع مطياف الكتلة الثلاثي رباعي الأقطاب API 3000 (AB SCIEX) المجهز بمصدر التأين بالرش الكهربائي ، ويتم إجراء التحليل في وضع الأيونات الموجبة (ESI +).
وفقًا لتحليل شظية الأيونات الذي تم إجراؤه على BDDE ، تم تحديد الجزء ذي الكثافة الأعلى ليكون الجزء المقابل لـ 129.1 Da (الشكل 6).لذلك ، في وضع المراقبة متعدد الأيونات (MIM) للتقدير الكمي ، يكون التحويل الشامل (نسبة الكتلة إلى الشحن [m / z]) لـ BDDE هو 203.3 / 129.1 Da.كما أنه يستخدم وضع المسح الكامل (FS) ووضع المسح الأيوني للمنتج (PIS) لتحليل LC-MS.
من أجل التحقق من خصوصية الطريقة ، تم تحليل عينة فارغة (مرحلة متنقلة أولية).لم يتم الكشف عن أي إشارة في العينة الفارغة بتحويل جماعي قدره 203.3 / 129.1 Da.فيما يتعلق بتكرار التجربة ، تم تحليل 10 حقن معيارية من 55 جزء في البليون (في منتصف منحنى المعايرة) ، مما أدى إلى انحراف معياري متبقي (RSD) <5٪ (البيانات غير معروضة).
تم قياس كمية محتوى BDDE المتبقي في ثمانية أنواع مختلفة من BDDE معقمات هيدروجيل HA متشابكة ، تقابل أربع تجارب مستقلة.كما هو موضح في قسم "المواد والطرق" ، يتم تقييم التقدير الكمي من خلال متوسط ​​قيمة منحنى الانحدار للتخفيف المعياري BDDE ، والذي يتوافق مع الذروة الفريدة المكتشفة في انتقال كتلة BDDE البالغ 203.3 / 129.1 Da ، مع الاحتفاظ الوقت من 3.43 إلى 4.14 دقيقة لا تنتظر.يوضح الشكل 2 مثالاً على مخطط كروماتوجرام للمعيار المرجعي BDDE 10 جزء في البليون.يلخص الجدول 1 محتوى BDDE المتبقي لثمانية هيدروجيلات مختلفة.نطاق القيمة هو 1 إلى 2.46 جزء في البليون.لذلك ، فإن تركيز BDDE المتبقي في العينة مقبول للاستخدام البشري (أقل من 2 جزء في المليون).
الشكل 2 مخطط كروماتوجرام أيوني لـ 10 جزء في البليون من المعيار المرجعي BDDE (Sigma-Aldrich Co) ، انتقال MS (m / z) الذي تم الحصول عليه بواسطة تحليل LC-MS لـ 203.30 / 129.10 Da (في وضع MRM الإيجابي).
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد ؛مرض التصلب العصبي المتعددم / ض ، نسبة الكتلة إلى الشحن.
ملحوظة: العينات من 1 إلى 8 يتم تعقيمها بالهيدروجيلات HA المترابطة عبر BDDE.كما تم الإبلاغ عن الكمية المتبقية من BDDE في الهيدروجيل وذروة وقت استبقاء BDDE.أخيرًا ، تم الإبلاغ أيضًا عن وجود قمم جديدة مع أوقات استبقاء مختلفة.
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛HA ، حمض الهيالورونيك.MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد ؛tR ، وقت الاستبقاء ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛RRT ، وقت الاحتفاظ النسبي.
من المثير للدهشة أن تحليل الكروماتوجرام الأيوني LC-MS أظهر أنه بناءً على جميع عينات هيدروجيل HA المتشابكة المتشابكة التي تم تحليلها ، كانت هناك ذروة إضافية في وقت الاحتفاظ الأقصر من 2.73 إلى 3.29 دقيقة.على سبيل المثال ، يوضح الشكل 3 مخطط الكروماتوجرام الأيوني لعينة HA المتشابكة ، حيث تظهر ذروة إضافية في وقت استبقاء مختلف يبلغ حوالي 2.71 دقيقة.تم العثور على وقت الاستبقاء النسبي الملحوظ (RRT) بين الذروة التي لوحظت حديثًا والذروة من BDDE لتكون 0.79 (الجدول 1).نظرًا لأننا نعلم أن الذروة المرصودة حديثًا يتم الاحتفاظ بها بدرجة أقل في عمود C18 المستخدم في تحليل LC-MS ، فقد تتوافق القمة الجديدة مع مركب أكثر قطبية من BDDE.
الشكل 3 الشكل اللوني الأيوني لعينة هيدروجيل HA المتشابكة التي تم الحصول عليها بواسطة LC-MS (تحويل الكتلة MRM 203.3 / 129.0 Da).
الاختصارات: HA ، حمض الهيالورونيك.LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد ؛RRT ، وقت الاحتفاظ النسبي ؛tR ، وقت الاستبقاء.
من أجل استبعاد احتمال أن تكون القمم الجديدة التي تمت ملاحظتها قد تكون ملوثات موجودة أصلاً في المواد الخام المستخدمة ، تم أيضًا تحليل هذه المواد الخام باستخدام نفس طريقة تحليل LC-MS.تشتمل مواد البدء التي تم تحليلها على الماء ، و 2٪ NaHA في الماء ، و 1٪ NaOH في الماء ، و BDDE بنفس التركيز المستخدم في تفاعل الارتباط المتقاطع.لم يُظهر مخطط الكروماتوغرام الأيوني للمادة الأولية المستخدمة أي مركب أو ذروة ، ووقت استبقاءه يتوافق مع الذروة الجديدة التي لوحظت.تتجاهل هذه الحقيقة فكرة أن مادة البداية قد لا تحتوي فقط على أي مركبات أو مواد قد تتداخل مع إجراء التحليل ، ولكن لا توجد أي علامة على التلوث المتبادل المحتمل مع المنتجات المختبرية الأخرى.تظهر قيم التركيز التي تم الحصول عليها بعد تحليل LC-MS لـ BDDE والقمم الجديدة في الجدول 2 (العينات 1-4) والرسم اللوني الأيوني في الشكل 4.
ملاحظة: العينات من 1 إلى 4 تتوافق مع المواد الخام المستخدمة في إنتاج هيدروجيل HA المترابط عبر التعقيم.لم يتم تعقيم هذه العينات.
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛HA ، حمض الهيالورونيك.LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد.
يتوافق الشكل 4 مع مخطط كروماتوجرام LC-MS لعينة من المادة الخام المستخدمة في تفاعل الارتباط المتقاطع لـ HA و BDDE.
ملحوظة: يتم قياس كل هذه العناصر بنفس التركيز والنسبة المستخدمة لتنفيذ تفاعل الارتباط المتبادل.تتوافق أرقام المواد الخام التي تم تحليلها بواسطة كروماتوجرام مع: (1) ماء ، (2) 2٪ محلول مائي HA ، (3) 1٪ محلول مائي هيدروكسيد الصوديوم.يتم إجراء تحليل LC-MS للتحويل الشامل لـ 203.30 / 129.10 Da (في وضع MRM الإيجابي).
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛HA ، حمض الهيالورونيك.LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد.
تمت دراسة الظروف التي أدت إلى تكوين قمم جديدة.من أجل دراسة كيف تؤثر ظروف التفاعل المستخدمة لإنتاج هيدروجيل HA المتشابك المتشابك على تفاعل عامل الارتباط المتقاطع BDDE ، مما يؤدي إلى تكوين قمم جديدة (منتجات ثانوية محتملة) ، تم إجراء قياسات مختلفة.في هذه التحديدات ، قمنا بدراسة وتحليل رابط التشابك النهائي BDDE ، والذي عولج بتركيزات مختلفة من هيدروكسيد الصوديوم (0٪ ، 1٪ ، 0.1٪ ، 0.01٪) في وسط مائي ، متبوعًا أو بدون تعقيم.إجراء البكتيريا لمحاكاة نفس الظروف هو نفس الطريقة المستخدمة لإنتاج هيدروجيل HA المتشابك.كما هو موضح في قسم "المواد والطرق" ، تم تحليل الانتقال الشامل للعينة بواسطة LC-MS إلى 203.30 / 129.10 Da.يتم حساب BDDE وتركيز الذروة الجديدة ، وتظهر النتائج في الجدول 3. لم يتم اكتشاف قمم جديدة في العينات التي لم يتم تعقيمها ، بغض النظر عن وجود هيدروكسيد الصوديوم في المحلول (العينات 1-4 ، الجدول 3).بالنسبة للعينات التي تم تعقيمها ، يتم اكتشاف قمم جديدة فقط في وجود هيدروكسيد الصوديوم في المحلول ، ويبدو أن تكوين الذروة يعتمد على تركيز هيدروكسيد الصوديوم في المحلول (العينات 5-8 ، الجدول 3) (RRT = 0.79).يوضح الشكل 5 مثالاً على مخطط كروماتوجرام أيوني ، يُظهر عينتين مُعقمتين في وجود أو عدم وجود NAOH.
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد.
ملاحظة: مخطط الكروماتوغرام العلوي: عولجت العينة بمحلول مائي 0.1٪ هيدروكسيد الصوديوم وتعقيمها (120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).مخطط الكروماتوجرام السفلي: لم تتم معالجة العينة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ، ولكن تم تعقيمها تحت نفس الظروف.تم تحليل التحويل الشامل لـ 203.30 / 129.10 Da (في وضع MRM الإيجابي) بواسطة LC-MS.
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد.
في جميع العينات التي تم تعقيمها ، مع هيدروكسيد الصوديوم أو بدونه ، انخفض تركيز BDDE بشكل كبير (حتى 16.6 مرة) (العينات 5-8 ، الجدول 2).قد يرجع الانخفاض في تركيز BDDE إلى حقيقة أنه في درجات الحرارة المرتفعة ، يمكن أن يعمل الماء كقاعدة (nucleophile) لفتح حلقة الإيبوكسيد لـ BDDE لتشكيل مركب 1،2-diol.تختلف جودة النظائر الأحادية لهذا المركب عن جودة BDDE وبالتالي لن تتأثر.اكتشف LC-MS تحولًا جماعيًا قدره 203.30 / 129.10 Da.
أخيرًا ، تُظهر هذه التجارب أن توليد قمم جديدة يعتمد على وجود BDDE و NAOH وعملية التعقيم ، ولكن لا علاقة له بـ HA.
تم بعد ذلك تمييز الذروة الجديدة التي تم العثور عليها في وقت استبقاء يبلغ حوالي 2.71 دقيقة بواسطة LC-MS.لهذا الغرض ، تم تحضين BDDE (9.9 مجم / مل) في محلول مائي 1 ٪ هيدروكسيد الصوديوم وتعقيمها.في الجدول 4 ، تتم مقارنة خصائص الذروة الجديدة مع الذروة المرجعية المعروفة لـ BDDE (زمن الاستبقاء حوالي 3.47 دقيقة).بناءً على تحليل تجزئة الأيونات للقمتين ، يمكن استنتاج أن الذروة مع وقت استبقاء 2.72 دقيقة تُظهر نفس الأجزاء مثل ذروة BDDE ، ولكن بكثافة مختلفة (الشكل 6).بالنسبة للذروة المقابلة لزمن الاستبقاء (PIS) البالغ 2.72 دقيقة ، لوحظت ذروة أكثر كثافة بعد التجزئة عند كتلة 147 Da.عند تركيز BDDE (9.9 مجم / مل) المستخدم في هذا التحديد ، لوحظت أيضًا أوضاع امتصاص مختلفة (الأشعة فوق البنفسجية ، λ = 200 نانومتر) في الطيف فوق البنفسجي بعد الفصل الكروماتوغرافي (الشكل 7).لا تزال الذروة مع وقت استبقاء 2.71 دقيقة مرئية عند 200 نانومتر ، بينما لا يمكن ملاحظة ذروة BDDE في مخطط الكروماتوجرام تحت نفس الظروف.
الجدول 4 نتائج توصيف الذروة الجديدة مع وقت استبقاء حوالي 2.71 دقيقة وذروة BDDE مع وقت استبقاء 3.47 دقيقة
ملاحظة: للحصول على هذه النتائج ، تم إجراء تحليلات LC-MS و HPLC (MRM و PIS) على القمتين.لتحليل HPLC ، يتم استخدام الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 200 نانومتر.
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛HPLC ، كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد ؛م / ض ، نسبة الكتلة إلى الشحن ؛PIS ، مسح أيون المنتج ؛ضوء فوق بنفسجي ، ضوء فوق بنفسجي.
ملاحظة: يتم الحصول على شظايا الكتلة عن طريق تحليل LC-MS (PIS).مخطط الكروماتوغرام العلوي: الطيف الكتلي لشظايا عينة معيارية BDDE.مخطط الكروماتوغرام السفلي: الطيف الكتلي للذروة الجديدة المكتشفة (RRT المرتبط بذروة BDDE هو 0.79).تمت معالجة BDDE في محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 1 ٪ وتعقيمه.
الاختصارات: BDDE ، 1،4-butanediol diglycidyl ether ؛LC-MS ، اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي ؛MRM ، مراقبة التفاعل المتعدد ؛PIS ، فحص أيون المنتج ؛RRT ، وقت الاحتفاظ النسبي.
الشكل 7 مخطط كروماتوجرام أيوني لأيون السليفة 203.30 دا ، و (أ) الذروة الجديدة بوقت استبقاء 2.71 دقيقة و (ب) الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية لذروة BDDE المرجعية القياسية عند 3.46 دقيقة عند 200 نانومتر.
في جميع الهلاميات المائية HA المتشابكة التي تم إنتاجها ، لوحظ أن تركيز BDDE المتبقي بعد تقدير LC-MS كان أقل من 2 جزء في المليون ، ولكن ظهرت ذروة جديدة غير معروفة في التحليل.هذه الذروة الجديدة لا تتطابق مع منتج BDDE القياسي.خضع المنتج القياسي BDDE أيضًا لتحليل تحويل الجودة نفسه (تحويل MRM 203.30 / 129.10 Da) في وضع MRM الإيجابي.بشكل عام ، تُستخدم طرق تحليلية أخرى مثل اللوني كاختبارات حدية لاكتشاف BDDE في الهلاميات المائية ، لكن الحد الأقصى للكشف (LOD) أقل قليلاً من 2 جزء في المليون.من ناحية أخرى ، حتى الآن ، تم استخدام NMR و MS لتوصيف درجة الارتباط المتبادل و / أو تعديل HA في أجزاء وحدة السكر لمنتجات HA المتصالبة.لم يكن الغرض من هذه التقنيات هو تحديد كمية اكتشاف BDDE المتبقية بتركيزات منخفضة كما وصفنا في هذه المقالة (LOD لطريقة LC-MS الخاصة بنا = 10 جزء في البليون).